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      三種常用的細胞增殖、毒性檢測方法的原理、特點與比較
       
        同時檢測LDH釋放及活細胞(MTT、CCK-8等方法)的文獻數量變化
                          (本數據由同仁化學研究所調查)

      方法

      MTT

      CCK-8

      LDH

      產品

      MTT

      CCK-8CK04

      Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®(CK12)

      檢測對象

      活細胞

      活細胞

      死細胞

      檢測結果

      細胞存活率

      細胞存活率

      細胞死亡(損傷)

      用途

      細胞增殖毒性

      細胞增殖毒性

      細胞毒性、細胞損傷

      底物

      MTT

      WST®-8

      WST®

      底物作用對象

      線粒體內脫氫酶

      細胞內脫氫酶

      乳酸脫氫酶(LDH

      檢測方法

      比色法

      比色法

      比色法

      Formazan水溶性

      不溶于水

      溶于水

      溶于水

      優點

      成本低

      重現性好

      無需使用放射性同位素51Cr

      靈敏度高

      適合做效靶細胞實驗

      操作簡便

      適合做ADCC、CART實驗

      試劑穩定性高

      試劑穩定性高

      對細胞毒性小

      對細胞毒性小

      Formazan溶于水

       

      適合高通量篩選

       

      缺點

      Formazan不溶于水,需用有機溶劑溶解

      CCK-8試劑和酚紅顏色接近,有時會有漏加或多加的情況

      血清濃度高時會有干擾

      對細胞有毒性

      靈敏度比放射性同位素51Cr

      操作繁瑣,增加誤差

      不適合懸浮細胞

      試劑需現配現用

      產品性狀

      粉末

      液體

      液體、凍干粉

       
       MTT法檢測原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜(Formazan),而死細胞無此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波長處測定其吸光度值,可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。
             Cell Counting Kit-8(CCK-8)法原理CCK-8中的主要成分WST®-8能被細胞內的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲臜,生成甲臜的量與細胞數成正比,可間接測定活細胞數量。
             乳酸脫氫酶(LDH)法檢測原理:乳酸脫氫酶(LDH)是存在于細胞質的一種酶,當細胞膜受到損傷時,LDH 會釋放到培養基中。由于釋放出的LDH 穩定,檢測培養基中LDH 的量可以作為測定死細胞和受損細胞數量的指標。
      Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®可以測定受損細胞所釋放出的LDH,其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH,NADH 通過電子載體可將水溶性四唑鹽WST®(無色)還原成甲臜產物(橙色),WST®甲臜產物的吸光度與LDH 的量呈正比,利用此原理可以測定死細胞和受損細胞的數量。
               MTT法和CCK-8法反映的是細胞的存活率,雖然也可以間接反映細胞毒性,但當外在因素改變(線粒體)脫氫酶活性時,有時結果就會出現偏差。這時最好的方法是同時測定LDH的釋放來驗證細胞的損傷率,用2種方法來相互驗證會使結果更可靠,更有說服力。
              在體外細胞損傷模型實驗中,往往需要同時檢測多種指標來驗證,例如:細胞存活率(MTT法或
      CCK-8法)、細胞凋亡(Annexin V-FITC)、細胞損傷(LDH法)、ROS、SOD、GSH、MDA、線粒體膜電位等指標。有關詳細內容請參見體外細胞損傷模型的檢測指標
      。
        
        
      【相關產品】
      Cell Counting Kit-8(貨號:CK04)                             
      〇 MTT
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      使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®的細胞損傷實驗
       
        1960年Nachlas等進行了以乳酸脫氫酶(LDH)的釋放為指標的細胞損傷實驗后,以檢測LDH作為一種確認細胞狀態方法的相關文獻在全球的數量越來越多(圖1)。本次例舉4篇近年發表過的文獻,均通過檢測LDH的釋放確定細胞損傷率。
        Watanabe等研究水通道蛋白(AQP,膜蛋白質)的機理及與疾病的關聯1)。已知AQP與細胞內水的轉運有關,近年的研究表明,AQP也會透過甘油、H2O2等小分子,甚至對細胞增殖及遷移產生影響。Watanabe等為證實AQP-9對H2O2轉運的影響,通過利用siRNA得到AQP-9基因沉默的HepG2細胞及H2O2熒光探針(CM-H2DCFDA)進行細胞對外源性H2O2的抑制實驗。實驗中,利Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®測LDH的釋放并確定由抑制H2O2轉運引起的細胞傷率。結果,對照組正常細胞進行H2O2轉運并檢測到CM-H2DCFDA熒光,同時檢測出LDH釋放確認細胞受損。實驗組細胞敲除AQP-9,細胞內沒有檢測出H2O2,并通過測定LDH的釋放確認沒有發生細胞損傷(圖2)。
       
       
      圖2  檢測AQP-9敲除的細胞內H2O2及LDH的釋放
       
        Shu-fang Jin等研究突發性肺纖維化治療藥Pirfenidone(圖3)的作用機能,其中合Cell Counting Kit-8(CCK-8)Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®進行評價2)。結果Pirfenidone對老鼠纖維芽細胞C3H10T1/2的增殖及纖維化有一定抑制并能夠增強激酶抑制劑XL413的效果,利CCK-8檢測XL413加入前后,Pirfenidone對細胞增殖的抑制率,結Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®確認細胞的增殖抑制并非由XL413本身引起。
       
       
      圖3  Pirfenidone及XL413的結構式
       
        此外,Liping Wu等研究弱酸刺激人上皮細胞(HEECs)ATP的釋放,同時確認有無LDH釋放增加3)。Wakatsuki等使用6-hydroxydopamine對原代神經細胞誘導凋亡后,以caspase3、Annexin VLDH為指標進行測定4)。對于細胞損傷而言,通過檢測幾種不同原理的指標進行實驗結果的相互驗證。同仁化學研究所生產并銷售各類細胞增殖、毒性、損傷檢測試劑盒及細胞染色等試劑,旨在以此幫助實驗者闡明細胞內各類機理。
       
        
      《參考文獻》
       
      1)  S. Watanabe, et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2016, 471, 191.
      2)  S. Jin, et al., Exp. Cell. Res., 2015, 339, 289.
      3)  L. Wu, et al., Am. J. Physiol. Gastroinest. Liver Physiol., 2015, 309, G695.
      4)  S. Wakatsuki, et al., J. Cell. Biol., 2015, 211, 881.
       
      技術支持:
      上海:021-6427-2302;北京:010-82251765